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蛋白质的化学修饰ppt

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蛋白质的化学修饰ppt

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这是蛋白质的化学修饰ppt下载,主要介绍了概述;蛋白质功能基的超反应性;控制修饰反应的专一性;确定修饰程度和修饰部位;化学修饰结果的解释;蛋白质侧链的修饰;羧基的修饰,欢迎点击下载。

一、概述指在温和条件下,蛋白质侧链基团与化学试剂形成专一性共价键的反应。涉及蛋白质侧链及修饰剂的反应性两个方面 化学修饰的意义 改造蛋白质,改善其功能性质,使适用于更广泛领域;科学研究,例如酶的活性中心,致病性,药物生物大分子相互作用、药物设计等。特别注意:被修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其pK值相关。 影响蛋白质侧链基团pK值的因素有: ⑴微区极性决定基团解离状态的关键因素之一。例如,溶菌酶中第Glu35的γ-羧基在水溶液中的pKa=5.9;当其与抑制剂三-N-乙酰氨基葡萄糖结合后,此时Glu35的γ-羧基pKa=6.4,上升了0.5。可能是由于抑制剂的加入,改变了该酶的构象,使该残基微区极性降低之故。蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改变,这种改变对 Trp,Met和Cys的反应性影响最小; 对氨基和咪唑基的反应性影响较大; 而对Tyr,Hcys和COOH的反应性影响最大。此外,极性的变化也影响到反应类型。 ⑵氢键效应氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定性有重要影响,氢键的变化也可能导致pK发生改变。例如2-氯酚pK比2-溴酚pK值高0.7pH单位,这是由于氯与酚基形成氢键的能力比溴强。水杨酸的羧基可与其酚基形成氢键,结果使其羧基的pK值比正常值小1个pH单位,同时使酚基的正常pK10改变到pK13,因此,在蛋白质的酚基-羧基相互作用中,羧基的pK值应比正常值低,而酚基的pK值高于正常值。 ⑶静电效应蛋白质中组氨酸残基的pK值是不同的。例如,碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基,pK值分别是:碳酸酐酶: 5.91 6.04 7.00 7.23 葡萄球菌核酸酶: 5.37 5.71 5.74 6.50 组氨酸在这两个蛋白质中的pK值范围是5.37~7.23,几乎相差2个pH单位,可能是邻近带电基团相互影响所致。总之影响蛋白质可解离氨基酸侧链pKa值、可影响这些侧链基团的反应性。蛋白质功能基的微区状态不同,反应性不同。功能基反应性差异可通过竞争标记法来测定。 ⑷位阻效应蛋白质表面的侧链基团旁有烷基等较大基团时,有基团空间位阻,影响与修饰剂接近及反应。例如,枯草杆菌蛋白酶的所有10个Tyr残基均在分子表面,而且其酚羟基几乎都不形成氢键。对它进行彻底硝化和碘化,10个Tyr中也只有8个被修饰,这很可能是空间障碍所引起的。此外,电荷转移,共价键形成,金属鳌合等都会改变蛋白质功能基的反应性。 ⒉蛋白质功能基的超反应性超反应性是指蛋白质中的某侧链基团与某试剂发生反应的能力。超反应性基团一般与蛋白质的某种功能性有关。超反应基团并不一定在酶的活性中心。例如,木瓜蛋白酶中的19个Tyr残基中只有一个能与二异丙基氟磷酸反应,该残基被修饰后并不一定使酶活性发生改变。修饰剂修饰蛋白质反应的活性由以下因素所决定: ⑴选择吸附修饰剂与蛋白质功能基之间的选择性吸附越强,反应性越大。 ⑵静电相互作用带电荷的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的某一残基定位。 ⑶位阻因素蛋白质表面的位阻,或底物、辅助因子、抑制剂产生的位阻都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。例如,α-溴代丁酸可烷化核糖核酸酶His12,而且反应很快;若用α-溴代戊酸修饰,则很难进行反应;α-溴代己酸则不能发生反应,这显然与位阻有关。 ⑷催化因素修饰部位附近的其它功能基,若有酸碱催化作用,也能影响修饰反应。例如,对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐以同一机理对胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸进行乙酰化,但苯乙酸盐反应性差,这与酶的酸碱催化有关。硝基苯乙酸盐对丝氨酸酶的反应性较高,这与Ser附近的路易斯碱与羧酸羟基氢作用,削弱该氧原子对羧基碳的吸电子相互作用有关。 ⑸局部环境的极性溶剂极性可能与反应速度有关,如下表: 反应类型 降低极性对速度的影响 ⒈RSR+ICH2CONH2 [R2S+CH2CONH2]I- 适当或大大降低 ⒉RSR+H2O2 R2SO+H2O 没有影响 ⒊RS-+ ICH2CONH2 R2SCH2CONH2+I- 没有影响 ⒋RN+H3+OCN- RNHCONH2 适当或大大增加疏水环境能阻止产物电荷分离的反应(反应1),并能加速电荷中和的反应(反应4);对于反应2(没有电荷分离)和反应3,电荷只是从一个离子转移到另一个离子,则介质是的极性是不重要的。二、化学修饰的方法学进行蛋白质修饰时,首先是选择修饰剂和修饰条件,以期提高修饰反应的专一性,获得满意的修饰结果。其次,在修饰反应过程中,要建立适当的方法追踪反应进程,以获得与修饰有关的数据。然后分析获得的数据,确定修饰部位和修饰程度,提出对修饰结果的合理解释。一、控制修饰反应的专一性探索性研究时,对修饰对象的了解不多,所以选择修饰剂和修饰条件至关重要,选择的正确性直接影响到修饰反应的专一性和有效性。 ⒈试剂选择不同实验,对修饰的专一性要求也不同,因此选择试剂在很大程度上要依赖修饰目的。例如,对氨基的修饰,仅修饰氨基;仅修饰α-氨基;修饰暴露的或反应性高的氨基。一般通过选择试剂和反应条件来控制修饰的部位和程度修饰对有机溶剂不稳定的蛋白质,必须在水介质中进行,应选择在水中有一定溶解度的试剂。在选择试剂时,应考虑反应生成物容易进行定量测定,即有特殊的光吸收或同位素标记等。选择试剂时,应注意其体积,体积过大,引起的空间障碍大,而不能或不易与作用的基团接近。一般而言,试剂体积较小为宜。选择试剂时,应该考虑修饰反应要达到的程度;修饰后蛋白质构象是否基本保持不变;是否需要分离修饰后的衍生物,反应是否需要可逆等因素。总之理想的修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应该具备以下特征: 即选择性地与一个氨基酸残基反应;反应须在酶蛋白不变性的条件下进行;标记的残基在肽中稳定,易通过降解分离并进行鉴定;反应程度可用简单的技术测定。但是,一种试剂往往不能同时满足上述所有条件,所以必须根据具体实验要求进行取舍。 ⒉选择反应条件修饰蛋白质的反应条件,除允许修饰反应能顺利进行外,还必须满足:不造成蛋白质的不可逆变性; 有利于专一性修饰蛋白质。为此,应尽量控制反应的温度、pH值、反应介质和缓冲液等,以保证蛋白质特定空间构象尽量不变。 ⒊反应的专一性专一性对蛋白质的化学修饰至关重要,用以下途径可以保证修饰的专一性: ⑴选择专一性试剂蛋白质分子的特殊空间结构能影响其某些基团的活性。例如DFP能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用,导致酶迅速失活。 ⑵选择不同的反应pH 均受pH的影响,控制反应pH值,可调控蛋白质分子各功能基的解离程度,从而控制修饰反应的专一性。例如,用碘乙酸或其酰胺可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及α-氨基、ε-氨基发生作用;pH6时,它只专一的与组氨酸的咪唑基作用;pH值为3时,专一与Met作用(在酸性下,巯基和氨基都呈正离子,不活泼)。 ICH2COOH+蛋白质-SH 蛋白质-S-CH2COO-+H++I- (pH>7) ICH2COOH+蛋白质-S-CH3 蛋白质-S(-CH3)-CH2COO-+I- (pH3) ICH2COOH+蛋白质-NH2 蛋白质-NH-CH2COO-+H++I- (pH>8) ICH2COOH+蛋白质-His 蛋白质-His(N-CH2COO-)+H++I-(pH6) ⑶利用某些产物的不稳定性高pH下,用氰酸、二硫化碳、O-甲基异脲和亚氨基酸等可转变氨基成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用,但因pH高,形成的产物迅速被分解。 ⑷亲和标记亲和试剂先以非共价键结合到蛋白质的活性部位,再发生化学作用。因此亲和标记试剂必须与蛋白质作用的底物或抑制剂相似,可顺利到达修饰位点,而且还能与特定活性基团反应。例如,利用对甲基苯磺酸氯(CH3-C6H4-SO2Cl),就能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。 ⑸差别标记以底物或抑制剂保护蛋白质的活性部位基团,使其不能与修饰试剂作用,可修饰非必需基团。然后将过量的底物或抑制剂除去,获得部分修饰的蛋白质。将其与同位素标记的同样试剂作用,则获得带有放射性同位素标记的蛋白质活性中心基团。 ⑹利用蛋白质状态的差异在不同状态下,蛋白质的构象有差异,暴露的基团也不同,因此在不同状态下修饰,可获得相关信息。例如,在结晶状态下修饰,可提高修饰的专一性。核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时,反应主要集中在His119,而对His12的修饰则很少,两者之比为60∶1;在溶液中该反应的比例为15∶1。二、确定修饰程度和修饰部位通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修饰部位。通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物,测定其同位素标记量或光谱强度或顺磁共振谱或荧光标记量等来确定反应程度。一般认为:测定被修饰的氨基酸,要比测定氨基酸的减少量更准确。三、化学修饰数据的分析 ⒈化学修饰的时间进程曲线以修饰时间对蛋白质活性作图可以了解修饰残基的性质和数目,修饰残基与蛋白质活性的关系,实际上是蛋白质失活速度常数的测定若蛋白质活性仅与某个残基有关,则可用公式(后面)表示 Log E1/E0 = - K失活·t E1为时间t时的活力,E0为初始活力, E1/E0为时间t时的残余活力若蛋白质活力与两个以上的残基有关,而且与修饰剂反应速度不相同,可获得多相修饰半对数图 ⒉确定必需基团的性质和数目蛋白质分子中某些侧链基团在功能上虽有必需和非必需之分,但它们往往都能与某一试剂起反应。 1961年Ray等提出用比较一级反应动力学常数来确定必需基团的性质和数目的方法,但是该法的局限性大,现基本被放弃。当n为已知时,x可由实验测得的m值计算而得。由上式两边取对数,以logα对log x作图得直线,其斜率即为必需基团数i。当n为未知时,x无法求得,但可根据上式给定一系列的i值(1,2,3……)。使得α1/i对m作图为一直线的那个i值。蛋白质分子中的必需基团和非必需基团与修饰剂的作用速度明显不同,假定该基团总数为n,并将其分为三类;一类是反应速度最快的必需基团,总数为s,二是p个反应速度较慢的基团,其中i个必需基团;三是反应最慢的基团,其数目为(n-p-s)。这时,活力的变化与修饰程度间的关系是: α1/i=(p +s - m)/ p或α1/i=(n/p)x -(n-p-s)/p,其中,m是被修饰的基团数,x=(n-m)/n为基团剩余分数。以α1/i对m或x作图,可以确定必需基团数i,也可由斜率和截距求得p和s。邹氏方法为蛋白质化学修饰研究由定性描述转入定量提供了理论依据和计算方法,可用于蛋白质设计。四、化学修饰结果的解释 ⒈蛋白质功能改变 ⑴确认试剂已经作用于蛋白质; ⑵确认修饰蛋白质的构象是否发生显著变化; ⑶确认修饰发生在何处,常用的方法有: ①修饰发生在活性部位的必须基团,蛋白质活性的丧失与修饰程度存在一定的化学计量关系。 ②底物保护与修饰蛋白失活程度的关系分析。 ⒉注意分析修饰残基的稳定性许多反应,如酰基转移、巯基转移、卤素转移及二硫键交换过程可能自发地或在纯化、降解过程中发生。例如,蛋白质中的碘代酪氨酸除对光和氧敏感外,在层析或在弱酸性介质中,有碘离子存在时,能发生脱碘化作用。又如,光敏化的组氨酸经酸水解后,产生许多未知产物,但这些未知产物峰的位置与正常氨基酸的峰位重叠。应引起特别注意,以区分修饰的真伪。四、蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链上的功能基主要有;氨基、羧基、巯基、吲哚基、胍基、甲酰基等,修饰上述每一种功能基都有好多种试剂可以利用,这里不再介绍。仅介绍那些应用广泛,又能达到某种特殊目的的试剂,并且以专一性为主。 ⒈氨基的修饰氨基的修饰可分为三类:引入正电荷的修饰;电荷消失的修饰;引入负电荷的修饰。赖氨酸的ε-NH2以非质子化形式存在时很活泼,可被选择性修饰 ⑴引入正电荷的修饰下列试剂修饰氨基后,在赖氨酸侧链上留下可电离的带正电基团 ①还原烷基化醛与赖氨酸侧链反应形成席夫碱,再用硼氢化钠还原席夫碱,获得稳定衍生物 E-NH2 + RCHO E-NH-CHR E-NH-CH2R 所用的醛可有不同的R基团,如甲醛、乙醛、丙醛等,用这些试剂修饰,可获得侧链微环境方面的信息 ②用烃基亚酰胺脒化(例如甲基乙亚酰胺)反应所产生的衍生物在酸、中性pH下稳定,在碱性pH下不稳定 ⑵消除电荷的修饰这类试剂可抑制赖氨酸的ε-NH2的质子化,使形成的衍生物不带电。 ①乙酰化在微碱性pH下,乙酸酐很容易与氨基作用,但是乙酸酐此时也能与巯基和咪唑基发生反应,应在较低温度下进行。 ②甲氨酰化作用氰酸盐与氨基反应形成非常稳定的衍生物,同时能与巯基、酚基、羧基、咪唑基发生反应,然而,除氨基衍生物外,其余反应产物在微碱性(pH~8)条件下不稳定,该反应应用广泛,一个明显的优点是氰酸盐离子体积小。 ⑶引入负电荷的反应 ①磷酸吡哆醛修饰磷酸吡哆醛修饰专一修饰氨基,赖氨酸残基在中性pH下与磷酸吡哆醛(PLP)反应,形成希夫碱,再用硼氢化钠(NaBH4)还原,得赖氨酸的不可逆修饰物,此产物不仅带负电,而且在325nm处有最大吸收,可用于定量测定。产物还有强烈荧光。 ⑵酰化反应 ⒊精氨酸胍基的修饰具有邻位羰基的化合物可与精氨酸的胍基形成稳定的杂环产物,常用的试剂有丁二酮,苯甲酰甲醛和乙二醛。虽然胺或巯基也能与试剂作用,但在中性pH下,其反应速度远比胍基慢。在碳酸氢盐缓冲液中,苯甲酰甲醛与精氨酸反应较快,而α-NH2在同样条件下不反应。 ⒋羧基的修饰用水溶性碳二亚胺专一修饰蛋白质中的羧基。在这个修饰中,碳二亚胺先活化羧基,活化的中间体通过O N酰基转移而重排,或者与加入的亲核物形成相应的酰胺,该法应用广泛。丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸在一定条件下也能发生该反应 ⑸巯基的修饰半胱氨酸是蛋白质中反应性最强的残基,所以很多试剂可用来修饰巯基侧链,常用的试剂有三类,即碘乙酸和碘乙酰胺或环乙烯亚胺;马来酰亚胺或马来酸酐;有机汞试剂如对氯汞苯甲酸,其反应分别如下 ⑹组氨酸咪唑基的修饰常用试剂是焦磷酸二乙酯和碘乙酸,用碘乙酸烷化组氨酸残基可获得单取代或双取代的衍生物焦碳酸二乙酯修饰组氨酸特别有用,它在中性pH下有较好的专一性,能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化,产物在240nm处有最大吸收,可用来追踪反应和定量测定。 ⑺色氨酸吲哚基的修饰 N-溴代琥珀酸亚胺(NBS)常用来修饰色氨酸,它使吲哚基氧化成为羟基吲哚衍生物,导致吲哚基在280nm处的吸收值降低。该反应必须小心进行,若浓度过大,可使修饰的色氨酸残基处的肽键断裂。此外,酪氨酸也能与NBS作用并干扰吲哚基的测定。各种苄基卤化物能使吲哚基环烷基化,最常用的是2-羟基-5-硝机基苄基溴及其类似物二甲基(2-羟基-5-硝基苄基)锍盐。这些试剂在没有半胱氨酸残基时,对色氨酸是很专一的五、化学交联技术在蛋白质研究中的应用定义:用双功能试剂或交联剂将两个分子结合起来的化学反应。在蛋白质中,其肽链末端基团及侧链亲核基团都是交联的功能基,因此,交联技术广泛用于研究蛋白质的活性基团。目前,交联仍是研究蛋白质活性基团等的最有效,最多样化的技术之一。该技术可用于研究蛋白质的相互作用,不但可以确定蛋白质的相邻亚基,还可以确定相互作用蛋白质间的最大间距等。在交联时要使用交联剂(包括使用酶)必须注意两点:交联是一个经验过程,无法预测哪种蛋白质在何种条件下与何种交联剂发生反应,需要对各种实验条件及试剂进行筛选以获得最佳交联效果;其次,对未发生交联的原因解释要极其谨慎,即遵守“无证据并不证明不存在”的格言。对于两个发生交联的相互作用蛋白质,其功能基团如侧链,需要正确定位且有足够的活性,才会被适当的交联剂所修饰。 ⒈体内与体外交联反应的特点交联法既可在体外、也可在体内进行。在体内,蛋白质组分的复杂性及集中度要远远大于体外环境,因此,应使用短交联剂就可达到交联邻近的蛋白质的目的。 ⑴体内交联的特点在体内,只有有相互作用关系的蛋白质之间才可能“临近”,因此体内交联更具有特异性。在体内交联研究时,通常使用脂溶性疏水性交联剂,例如甲醛,CS2,碳化二亚胺等,他们可以穿过细胞膜。但是,一定要注意到:要确定或控制细胞内交联特异性最适合条件是极其困难的;此外,交联剂可以与大量其它蛋白质相互作用,其中包括细胞表面蛋白,整合膜蛋白,胞浆内蛋白及核蛋白。而且代谢产物及非蛋白组分也是交联剂的潜在竞争剂,特别是当它们具有与蛋白质侧链同类的反应基团时,如胺类、羧化物或者硫醇。 ⑵体外蛋白质交联的特点在体外交联更有可能同时控制交联的特异性及条件。例如,水溶性及脂溶性的交联剂可分别用于修饰相互作用的亲水区及疏水区。pH、反应物浓度及反应温度也易于控制。体外交联还允许对蛋白质及其复合物的纯度进行优化,以使蛋白质的交联模式更易解释。体外交联的另一个优点是有大量的交联剂可以选择。 ⑶注意事项必须以交联目的来选择交联方法。例如,想要说明整合膜蛋白质的相互作用最好选用体内交联方法;研究细胞因子受体之间的相互作用是在激活配体的情况下将细胞表面受体交联,可在体外进行;而包浆内蛋白质之间的相互作用则既可在体外、又可在体内进行。只要有可能应尽量选用体外法进行交联。即使是在最适条件下进行交联反应,反应体系中也至少会产生三种不同的共价修饰形式,分别为单取代蛋白、分子内交联及分子间交联。单取代蛋白是指蛋白质仅被交联剂中的一个活性基团修饰时所形成的单取代连接分子内交联是指蛋白质或交联剂的浓度较低、或交联剂的长度只能在同一蛋白质内,而不是邻近空间相邻侧链形成交联桥时,易形成单个多肽链的分子内交联当交联剂的几何形状、化学性质、柔韧性、跨度均适合于共价连接两个分离蛋白的反应侧链时,则形成分子间交联蛋白质含有大量有活性的氨基酸侧链基团,可以被不同类型的化学交联剂选择性识别。氨基酸分为疏水的脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和亲水的极性氨基酸,除少数例外,均是第二类氨基酸中的亲核侧链参与交联。 ⒉pH的影响大部分交联反应都是亲核取代反应,其中,对亲核氨基酸侧链的攻击使一对电子转移至交联剂,造成交联剂离去基团的直接取代并在交联剂与蛋白质侧链间形成了共价键。所有这种亲核取代发生的反应速率依赖于交联剂的离去基团是否易被置换以及攻击侧链的亲核性。在蛋白质中发现的最有效的亲核侧链是R-S-,即阴离子的半胱氨酸去质子化硫酸盐。质子化会减低该基团及其它可电离的反应侧链作为电子对提供者的有效性,从而降低其亲核性。因此,pH是影响交联反应的最重要因素。例如pH从其pka上升两个单位,则去质子化侧链的百分比将从50%升至99%,反应活性也相应升高。 ⒊交联剂的类型最普通的化学交联剂是双功能试剂,即具有两种化学反应基团,可以与蛋白质靶的两条侧链发生反应,从而形成交联复合体的化合物。交联剂中将这两个反应基团相连接的部分称为间隔段或接合部。该间隔段除了确定着两个反应基团的距离外,还提供了其它重要特征。例如,间隔段内含有二硫键,就会对于还原剂产生的化学裂变异常敏感,这种化合物称为可裂变交联剂。间隔段也为分析交联剂的几何学参数及溶解性提供线索。同型双功能或异型双功能交联剂具有相同或不同反应基团的双功能交联剂分别称为同型双功能或异型双功能交联剂,异型双功能交联剂的优势在于可以用不同功能的基团选择不同类型的亲核侧链,而且可以使两步交联反应在不同的条件下单独进行。零距离交联剂这种交联剂可以激活靶蛋白侧链的功能性基团,无须插入任何外源间隔段即可在侧链间形成共价键。应用最多的零距离交联剂是碳二亚胺,它激活羧基形成活化的酰化异脲中间体,继而被胺类修饰,与氨基与羧基间形成酰胺键。氰也能将相互作用蛋白质之间的盐桥赖氨酸酰基与酸性氨基酸共价连接。由于氰是一种气体试剂,可以轻易穿过细胞膜,因此可以用于体内交联,转谷氨酰胺酶是另一种,催化相互作用蛋白质的谷氨酰基与赖氨酰基间形成异肽键. 交联的特异性及选择性交联的特异性是指通过交联检测到的蛋白质间可能发生的相互作用选择性是指交联剂对某种特定的氨基酸侧链的专一程度。特异性与选择性密切相关,选择性低的交联剂会造成大范围的修饰,因此其特异性低。用交联剂方法判断相互作用蛋白质时,控制交联的特异性是最关键点之一。在一步交联反应中,更是如此。否则,额外的交联极易发生,造成许多假阳性。例如pH高于8的交联反应,易去质子化并激活蛋白质表面许多亲核基团,使得蛋白质象一个棉球一样,吸附交联剂结合并最终吸附反应过程中与其接触的溶质分子,当交联剂的浓度远远高于靶蛋白时,这种情况也会发生。利用异型双功能交联剂反应基团的不同特性而产生两步交联反应,用于提高交联的特异性。在这种反应中,首先感兴趣的纯化蛋白常常被光活化异型双功能交联剂的化学反应基团修饰,过量的未共价连接的交联剂随即从被修饰蛋白中去除;第二步,这种单衍生化的蛋白质与其可能的蛋白质相互作用在一起,暴露于激发波长的光波中以形成交联。交联的特异性及间距(分子标尺及近邻法) 我们设想,聚合体中的蛋白质亚基只有在足够临近时才能发生具有生物学功能的相互作用,在此时研究蛋白质分子之间相互作用的方法就叫做临近法。这时就要利用一系列的同源交联剂来考察其作用间距。若待交联的亲核基团间的间距大于交联剂的长度,就无法实现交联,因此交联的特异性依赖于交联剂反应基团之间的距离。测定活性氨基酸残基间最大距离的基本方法是采用一系列同源的不同长度的间隔段或几何形状的交联剂来加以测定(即分子标尺)只有在保持同源的交联剂活性基团一致的情况下,才能排除交联剂在化学反应上的差异,从而简化对实验后果的分析。这种用分子标尺法确定的反应基团间的距离称为最大间距。因为距离小于交联剂伸展长度的反应基团也会由于交联剂可能的柔性而发生交联,而蛋白质的微动可能会使交联残基的间距测定更加复杂。交联筛选的流程图在交联筛选的流程图中,要注意以下几方面的程序,它们分别是,制备样品,对体内实验来说,蛋白质的数量一般要达到0.5-1亿个分子,(凝胶染色或免疫化学),若要使细胞内蛋白与将要进行交联的蛋白易于区分,还可在后者分子上进行标记,并将细胞外其他可能与内部蛋白交联的干扰物质用缓冲液洗去;对于体外反应要将蛋白质再不可能与交联剂反应的缓冲溶液中溶解或透析至终浓度0.05-0.5mg/mL,使pH达到7.5左右。筛选交联条件应注意:疏水交联剂要用合适的溶剂溶解(如碳二亚胺用乙醇),但应尽量配成浓度较大,使交联剂溶液加入量不超过总体积的15为宜,一般交联剂:蛋白质比例在10-100之间;控制温度、pH为最佳状态,一般情况下,碱性利于氨基交联,而低于中性pH则有利于巯基交联。交联反应灭活或淬灭这是交联反应的最后一步,就是向反应体系中加入可以与交联剂反应基团相竞争的过量亲核试剂,例如甘氨酸和Tris或其它试剂以避免额外的蛋白质交联。也可以加入SDS缓冲液进行漩涡振荡并在90度加热5分钟终止反应,还可以用蛋白质沉淀剂(如三氯乙酸、硫酸铵或聚乙二醇)。

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